Descripción del servicio secuenciación de plasmidos
El servicio de secuenciación completa de plásmidos está diseñado para la secuenciación completa y la anotación de ADN plasmídico circular clonal con longitudes entre 2.5 kb y 300 kb.
Con nuestro servicio recibirá los siguientes archivos:
fasta (archivo con la secuencia consenso del plásmido)
GenBank archivo con la secuencia del plásmido anotado
Opcionalmente se pueden solicitar los archivos fastq
Como preparar tus muestras de DNA plasmídico
Este servicio requiere 300 ng (plásmido pequeño), 1000 ng (plásmido mediano) o 2000 ng (plásmido grande) de ADN circular de doble cadena, normalizado a la concentración específica indicada en la tabla 1.
Por favor, envíe los plásmidos purificados finales en un tampón de elución (10 mM Tris, pH 8.5) o agua libre de nucleasas; le pedimos que evite el uso de tampones que contengan EDTA (por ejemplo, tampón TE o AE) siempre que sea posible.
Es importante señalar que las muestras de plásmidos se secuenciarán SIN el uso de primers, por lo tanto, le solicitamos AMABLEMENTE que NO incluya primers junto con sus muestras ni los mezcle en las mismas.
Es relevante tener en cuenta que nuestros precios bajos en secuenciación y los tiempos de entrega rápidos no cubren los servicios de extracción de ADN ni los servicios de control de calidad, por lo que le solicitamos que verifique que sus muestras cumplan con los requisitos mencionados anteriormente antes de proceder con el envío.
Verificar concentración
Por favor, envíe sus muestras de plásmidos estándar, grandes o enormes, normalizadas de acuerdo con la concentración específica y el volumen mínimo indicados en la tabla anterior. La cuantificación debe realizarse mediante el método Qubit o una técnica fluorométrica equivalente (como un lector de placas).
IMPORTANTE: Evite usar Nanodrop para la cuantificación de ADN, ya que los métodos espectrofotométricos NO son fiables para este propósito.
El envío de muestras con concentraciones demasiado altas o demasiado bajas puede tener un impacto negativo en la preparación de la biblioteca y/o en las reacciones de secuenciación, lo que podría resultar en un fracaso en el proceso de secuenciación. Enviar muestras con una concentración incorrecta (suele ser causado por la cuantificación con Nanodrop) es, por mucho, la causa más común de fallos en la secuenciación. Por lo tanto, una cuantificación precisa y una normalización adecuada son de vital importancia.
Verificar Calidad
Para obtener los mejores resultados, busque obtener plásmidos circulares de doble cadena intactos. Los plásmidos que estén degradados o fragmentados tienen muchas más probabilidades de provocar fallos en la secuenciación al no generar un consenso debido a la falta de lecturas de secuenciación de longitud completa.
La verificación del tamaño debe realizarse en plásmidos de longitud completa (NO en plásmidos digeridos o amplificados) mediante electroforesis en gel; utilice una escala lineal para plásmidos linealizados y una escala superenrollada para plásmidos circulares intactos.
La secuenciación Sanger y la amplificación por PCR NO son adecuadas para la verificación del tamaño, ya que estos métodos utilizan primers para detectar solo una región pequeña y específica.
Los flujos de trabajo para plásmidos medianos (25 - 125 kb) y plásmidos grandes (125 - 300 kb) son más tolerantes a la degradación, ya que es más difícil extraer plásmidos de estos tamaños sin cierto grado de degradación. Sin embargo, para obtener los mejores resultados, aún debe procurar obtener ADN circular intacto.
Verifique pureza
Recomendamos muestras con un radio 260/280 mayor a 1.8 y un radio 260/230 entre 2.0 y 2.2. El análisis de pureza se puede llevar a cabo con Nanodrop u otros métodos espectrofotométricos.
IMPORTANTE: No considere la concentración de ADN reportada por Nanodrop como un sustituto de la cuantificación fluorométrica mencionada anteriormente.
Para obtener los mejores resultados, las muestras NO deben contener ninguno de los siguientes elementos:
ARN (se recomienda el tratamiento con RNasa durante la extracción)
Desnaturalizantes (sales de guanidinilo, fenol, etc.) o detergentes (SDS, Triton-X100, etc.)
Contaminantes residuales del organismo (ácido húmico, polifenoles, etc.)
Material insoluble, colores o turbidez
Las muestras también deben ser "puras" en el sentido de que solo deben contener copias de una sola molécula de plásmido clonal. Enviar mezclas de especies moleculares dará resultados mixtos y será bajo su propio riesgo.
La secuenciación Sanger y la amplificación por PCR NO son adecuadas para verificar la pureza, ya que utilizan primers que se unen solo a una región pequeña y específica. Como resultado, se puede obtener una señal fuerte de secuenciación Sanger incluso si una fracción muy pequeña de las moléculas totales contiene la secuencia objetivo. Esto puede crear artificialmente la apariencia de una muestra pura que contiene solo una especie molecular, cuando en realidad otras especies moleculares que carecen de las secuencias de unión de primers también pueden estar presentes, pero no detectadas. Nuestro servicio de secuenciación de plásmidos completos producirá datos para todas las especies moleculares presentes en la muestra y, por lo tanto, es una representación mucho más precisa del contenido real de su muestra.
A veces, el ADN circular de cadena simple también puede tener resultados exitosos con este servicio de secuenciación de plásmidos. Sin embargo, no es una aplicación oficialmente respaldada, por lo que se puede probar bajo su propio riesgo.
¿Por qué falló mi muestra de plásmido?
En el caso de los plásmidos, "falla" se refiere a la incapacidad de su muestra para producir una secuencia de consenso con al menos 10 veces de cobertura.
Nuestros precios bajos de secuenciación y tiempos de entrega rápidos no incluyen un extenso control de calidad para determinar por qué las muestras de plásmidos fallan. Aunque no proporcionamos razones definitivas para el fallo, las razones más comunes son:
Muestras no preparadas a la concentración de ADN requerida. La causa más común de esto es utilizar un Nanodrop para cuantificar la concentración de ADN. Recomendamos encarecidamente usar un Qubit u otro método equivalente.
Puede observar evidencia de este problema al tener un numero reducido de lecturas reportados en el histograma de la longitud de las lecturas en bruto. (Tenga en cuenta que si decide evaluar los datos de muestras con números bajos de lecturas, el ruido puede superar la señal de secuenciación real, por lo que le aconsejamos precaución).
Las muestras contienen una mezcla de especies de plásmidos y/o ADN genómico fragmentado o plásmidos fragmentados.
Puede observar evidencia de este modo de fallo al obtener un rango amplio de longitudes de lecturas reportadas en el histograma de las lecturas en bruto.
Para lograr resultados óptimos en la secuenciación, por favor siga nuestros pasos recomendados de preparación de muestras y control de calidad.
¿Cuál es su política cuando las muestras de plásmidos fallan?
Es relativamente raro que no podamos devolver una secuencia de plásmido, pero algún nivel de fallo es inevitable. Podemos intentar secuenciar nuevamente muestras fallidas si la calidad y la cantidad de su muestra lo permiten. Si la muestra falla por segunda vez, concluiremos que algo en la muestra la hace no secuenciable. Consulte nuestro Flujo de Trabajo de Secuenciación. Desafortunadamente, aún debemos cobrar por muestras fallidas, ya que invertimos más tiempo y recursos en ellas de los que invertimos en muestras exitosas.
